病毒载体的安全性探究
一、简介
病毒载体是细胞治疗及基因治疗中最流行的递送方式。在细胞与基因治疗中，表达抗肿瘤、细胞毒性和免疫刺激基因的病毒载体，如CAR、细胞因子和趋化因子等，已被批准用于癌症、代谢、神经和眼科疾病等的治疗。与非病毒载体相比，病毒载体具有优越的基因传递能力，如递送效率高、对细胞损伤小等优点，因此在细胞与基因治疗中发挥了核心作用[1]。
二、逆转录病毒
（1）整合位点与安全事故
逆转录病毒（RVs）由于其逆转录活性，RNA基因组能够产生dsDNA拷贝并整合到宿主基因组中。染色体整合有利于长期的转基因表达，其中伽马逆转录病毒载体（γ-RVV）的整合倾向于插入基因的转录起始位点附近，在一次γ-RVV应用于基因治疗中，曾导致接受治疗的SCID-X1患者诱发白血病的不良事件[2]。因此，研究者们设计出自我失活的γ-RV载体 (SIN-γRVV)，该载体已被证明在临床实验中是安全的[3]。在腺苷脱氨酶缺陷严重联合免疫缺陷(ADA-SCID)中，γ-RVV治疗后插入性肿瘤发生极少见[4]，现如今上市的细胞产品底层技术逆转录病毒载体均为自失活载体，安全性高。慢病毒载体（LVV）偏好整合在活跃的转录单元中，同样也有一些不良事件和随机插入导致肿瘤发生的报道。2021年6月，美国蓝鸟生物公司暂停了LentiGlobin（BB305 LV）治疗镰状细胞病的2项临床试验，因为2名接受LentiGlobin治疗的患者分别被诊断出患有急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征[5]。因此，不论是慢病毒载体还是逆转录病毒载体均有随即插入致癌的风险，但概率极低（近千万分之一），截至目前，已上市的细胞产品中，无论是应用逆转录病毒载体还是慢病毒载体，均无随机整合而引发的安全性事故。
（2）复制型病毒风险
逆转录病毒载体或慢病毒载体也是CAR-T细胞治疗中将CAR基因高效地导入T细胞中的常用载体，但其有可能产生复制型逆转录病毒（Replication Competent Retroviruses，RCR）或复制型慢病毒（Replication Competent Lentivirus，RCL）污染的潜在风险。RCR/RCL一样可以整合在细胞基因组中，从而产生因整合出现的激活原癌基因、破坏抑癌基因或使促细胞生长的因子表达增高而造成插入性肿瘤的风险；另一方面，因其可产生具有复制能力的病毒，也同样增加了整合而造成插入性肿瘤的风险[6]。有研究者在体外输注骨髓祖细胞的试验中发现，使用γ-RV的10只严重免疫缺陷恒河猴中，有3只发生了淋巴瘤[7]。分析原因发现，淋巴瘤组织中检测到了RCR，并且出现淋巴瘤的动物发生了γ-逆转录病毒血症，这也是由RCR引起的[8]，因此动物发生淋巴瘤的真凶是RCR而非γ-逆转录病毒载体。类似地，由于慢病毒载体的包膜通常采用其它病毒的膜蛋白进行替换，如常用的VSV-G膜蛋白，这可能会增加RCL污染而带来的潜在风险[6]。因此，RCR/RCL的污染风险始终是我们要重点关注的一个安全性问题。
三、DNA病毒载体
DNA病毒载体主要包括腺病毒（AV）和腺相关病毒（AVV）。腺病毒是一种非包膜双链DNA病毒，腺病毒载体的基因导入后不会整合到基因组上，所以没有随机插入的风险。高免疫原性、细胞毒性及瞬时转基因表达仍使腺病毒载体研究充满挑战。1999年，一位患有鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷的18岁患者在全身注射大剂量腺病毒载体后死亡，原因是衣壳蛋白的固有免疫反应引发了细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS，又称细胞因子风暴)。目前，基于腺病毒载体的基因治疗主要应用于基因疫苗和抗肿瘤治疗[5]。AVV是具有单链DNA的无包膜细小病毒，其载体具有广泛的趋向性、低免疫原性和易于生产等特点，有利于临床应用。然而，有研究结果显示AAV递送的RNA干扰(RNAi)疗法可在非人灵长类脑中导致神经毒性[9] 。
四、小结
综上所述，病毒载体在细胞治疗中的应用是非常安全的，细胞药物研发中病毒载体仍为可靠、安全且高效的递送手段，但在相关基因治疗及干细胞相关治疗中要高度关注其病毒载体安全性问题。这需要我们不断地进行病毒载体工艺优化设计和生产、质控体系的控制，保证细胞与基因治疗产品的临床安全及有效性，以最小的安全性问题让基于病毒载体的细胞与基因治疗受益更多的患者。
参考文献
[1] Lundstrom K. Viral Vectors in Gene Therapy: Where Do We Stand in 2023? Viruses. 2023 Mar 7;15(3):698. doi: 10.3390/v15030698. PMID: 36992407; PMCID: PMC10059137.
[2]Hacein-Bey-Abina S, Garrigue A, Wang GP, Soulier J, Lim A, Morillon E, Clappier E, Caccavelli L, Delabesse E, Beldjord K, Asnafi V, MacIntyre E, Dal Cortivo L, Radford I, Brousse N, Sigaux F, Moshous D, Hauer J, Borkhardt A, Belohradsky BH, Wintergerst U, Velez MC, Leiva L, Sorensen R, Wulffraat N, Blanche S, Bushman FD, Fischer A, Cavazzana-Calvo M. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 2008 Sep;118(9):3132-42. doi: 10.1172/JCI35700. PMID: 18688285; PMCID: PMC2496963.
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[5]李嫚琪,魏丽萍,陶巧玉等.基因治疗递送载体应用现状及安全性研究进展[J].中国医药工业杂志,2022,53(12):1671-1682.DOI:10.16522/j.cnki.cjph.2022.12.001.
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