细胞治疗中安全性开关的应用
细胞治疗的安全开关
患者在完成自体或异体细胞输注后，大量免疫细胞被激活并快速增殖，引起IL-6、IL-1、IL-12、TNF-α、IFN-α、GM-CSF等细胞因子的过度级联释放，导致发生发热、低血压、毛细血管渗漏、缺氧和终末器官功能障碍等症状，也被称为细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome, CRS)。为了应对患者在接受细胞治疗后出现CRS，目前有两种方法，一方面可以通过CRS和神经毒性的预测性生物标志物来进行检测，通过密集的监测及时做出反应；另一方面是设计更加安全的细胞疗法，而目前已经达成共识的策略是给细胞装上“安全开关”，在人为可控下进行治疗，且在不良反应发生前及时踩刹车，将有助于减轻毒副作用。
随着技术的发展，通过提供或去除小分子，提供基于蛋白质的调节剂，或通过物理刺激，如光、超声波或热，对细胞产品进行可逆性控制已变得可行[1]。
安全性开关的类型
(一) 利用CID技术平台
CID是化学诱导二聚化（Chemical Induced Dimerization），所谓的CID技术平台（化学诱导的二聚体化技术）就是将特定DNA的分子导入靶细胞，使靶细胞表达CID蛋白(如FKBP12)和目的蛋白，再通过加入小分子化合物CID诱导使之发生二聚化，从而让相应的CID蛋白发挥自身的功能。CID蛋白包括信号区域和结合区域，加入二聚诱导剂（如rimiducid）可以使之与CID结合区域结合成二聚物，二聚物就会开启下游信号的级联反应。
Caspase-9是细胞凋亡信号通路的启动酶，激活后会产生信号级联反应并最终导致细胞凋亡。在过继性细胞治疗中可以通过转导iCasp9以此控制细胞的生命活动。iCasp9由CID蛋白序列通过linker与caspase9序列所组成（图1 B），细胞当暴露于二聚化诱导药物时，就会导致表达该结构的细胞快速死亡，减轻治疗中的严重副作用。
图1. iCasp9系统调控细胞凋亡[2]
(二) 利用靶向蛋白降解技术
有研究团队创建了一种分子开关来调节CAR-T细胞的活性，只需要给予一种常用的抗癌药物——来那度胺（lenalidomide）即可实现[3]。他们利用了一项被称为靶向蛋白降解的新颖技术，包括来那度胺在内的少数药物可以通过该途径靶向降解特定蛋白发挥作用。利用这一机制改造了小蛋白标签，当这种降解标签被贴在CAR上后，在施用来那度胺期间，来那度胺会结合到CAR结构的蛋白标签上去，就会诱导CRL4CRBN介导的泛素化和蛋白酶体降解，被标记的CAR就会被降解，从而阻止T细胞识别癌细胞。由于T细胞还会不断制造CAR蛋白，在撤除来那度胺后，新生成的CAR蛋白逐渐累积，CAR-T细胞恢复抗肿瘤功能。
图2. 利用来那度胺调控CAR结构的降解[3]
(三) 利用四环素（Tet）调控系统
简单地说，四环素(Tet)调控表达系统就是通过诱导药物如Tet改变调控蛋白质的构象，从而控制目的蛋白的表达。在细菌系统中，正常情况下，四环素阻遏蛋白（tetR）将与四环素抗性操纵子（tetO）结合，抑制下游抗性基因tetA的转录。当存在四环素或者四环素类似物如强力霉素（Dox）时，tetR将与四环素结合，不再和tetO结合，造成下游抗性基因tetA表达，四环素就会通过tetA蛋白运出到细胞外，细菌从而获得耐药性[4]。
图3. 大肠杆菌的四环素调控系统[4]
按照特点可以分为：激活性系统Tet-on和抑制型系统Tet-off。
Tet-off原理：tTA是由TetR和病毒转录激活域VP16融合而成的蛋白。当不存在Dox时， tTA和TRE（7个重复的TetO序列）结合，启动下游基因表达；当存在Dox时，tTA的构象发生改变，tTA会TRE上脱落，从而导致下游基因表达关闭。
Tet-on原理：rtTA是由rTetR和VP16融合而成的蛋白，它的表型与tTA相反 。rtTA是一种反Tet阻遏物(rTetR)，并依赖四环素的存在进行诱导，而不是抑制。当Dox不存在时，rtTA不能结合TRE, 下游基因表达关闭。当存在Dox时，rtTA的构象发生改变，rtTA集合TRE，下游基因表达开启。
可以利用四环素调控系统做到对目的基因表达的精准调控，以此来控制细胞是否表达CAR结构或者调控细胞的死亡。
参考文献
[1]Sahillioglu, A.C. and T.N. Schumacher, Safety switches for adoptive cell therapy. Curr Opin Immunol, 2022. 74: p. 190-198.
[2]Di Stasi, A., et al., Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med, 2011. 365(18): p. 1673-83.
[3]Jan, M., et al., Reversible ON- and OFF-switch chimeric antigen receptors controlled by lenalidomide. Sci Transl Med, 2021. 13(575).
[4]https://2013.igem.org/Team:Bielefeld-Germany/Biosafety/Biosafety System M.
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