细胞免疫疗法载体技术的现状与展望

深圳细胞谷史渊源教授和王建勋教授在中国生物工程杂志（CHINA BIOTECHNOLOGY）参与发表了《细胞免疫疗法载体技术的现状与展望》的综述。

近年我国细胞免疫治疗发展迅速,从零基础直追国际前沿水平。在细胞免疫疗法蓬勃发展的背后,将基因导入靶细胞并使其进行表达的基因递送载体技术的支持不可或缺。如何更加安全高效地进行基因转递也是困扰行业发展的重要瓶颈之一。通过总结目前细胞治疗领域主要应用的载体技术发展现状,并对比已经上市产品的工业化生产流程,以期为后续载体技术的发展提供参考。

本文摘取《细胞免疫疗法载体技术的现状与展望》，对逆转录病毒载体、慢病毒载体进行简单介绍。

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http://manu60.magtech.com.cn/biotech/article/2024/1671-8135/1671-8135-44-2-3-142.shtml

细胞免疫治疗是指通过采集人体的免疫细胞,经过体外培养以富集扩增其中某种免疫细胞或增加靶向性杀伤功能,然后再回输回患者体内,从而杀灭患者体内的病灶,通常是癌组织、病变细胞或病原体等。

细胞治疗作为一种治疗手段已经在临床崭露头角,2019年美国癌症年会就将其与手术、放疗、化疗和靶向治疗并列为癌症治疗的五大支柱。在其他疾病方面,细胞免疫治疗也逐渐成为发展的重要方向,也是继小分子、大分子靶向疗法之后的新一代精准疗法,其中基因编辑的过程非常重要,将外源基因导入免疫细胞中需要合适的载体技术。

以目前细胞免疫治疗中最火爆的CAR-T项目为例,下表总结了在我国和美国已经上市的细胞产品采用的基因递送载体技术,主要集中为两类病毒载体,即逆转录病毒载体和慢病毒载体。下文摘取综述中逆转录病毒载体的简要介绍。

逆转录病毒(retroviruses,RV)又称反转录病毒,是一种RNA病毒,其两端为长末端重复序列(LTR)。

逆转录病毒复制有一个必需步骤:在逆转录酶的作用下,其基因组RNA可被逆转录为前病毒DNA(proviral DNA),随后借助整合酶的作用通过前病毒两端LTR插入到宿主细胞的基因组中。一般来说,简单的逆转录病毒包含三个主要编码片段和一个小型编码域。主要片段包含三个基因——gag、pol和env,gag编码病毒的核心蛋白、pol编码逆转录酶、env编码病毒外膜糖蛋白。

作为最早被开发的一类病毒载体,通过多次改进,目前逆转录病毒载体(retroviral vector,RVV)仅具备单次感染能力,感染的宿主细胞不能产生可以复制的病毒,病毒载体的致病性大为下降。

主要上市和在研的产品大部分采用的是γ-逆转录病毒载体,现有的逆转录病毒载体主要分为三型。

第一型是双表达(double expression, DE)载体,含两个外源基因,一个基因取代gag/pol片段,表达为非剪接的RNA形式,且不含内含子序列。

第二型是具有内部启动子的载体,由于病毒载体内部有一个启动子,不同类型的启动子导致病毒的效价不同,选择合适的启动子可以提高10~50倍病毒效价,在较难转导的原代淋巴样细胞和骨髓祖细胞中有较广应用。

第三型被称为是自灭活载体(self-inactivating vector,SIN),该载体中3'LTR缺失增强子和启动子序列,它们的缺失并不影响病毒功能,但可以使病毒载体整合入靶细胞染色体时本身不具备活性,提高安全性。 

目前逆转录病毒载体生产制备的主要流程为:目的基因获取→构建质粒测序验证→病毒瞬时包装→筛选得到稳转细胞系→扩大培养→收获病毒上清液→纯化病毒。

科研级逆转录病毒载体的生产过程无须筛选稳转细胞系,过程较为简单,收获病毒产量较低,进行浓缩后可供科学研究使用。逆转录病毒载体工业化生产工艺更加完善,通过转染一种包装细胞并用这些细胞产生的病毒上清液转导另外一种包装细胞,然后筛选第二种包装细胞的稳转细胞系来收集逆转录病毒载体。

瞬时转染的病毒载体存在较大异质性,通过筛选稳转细胞系甚至挑选单克隆细胞库,使生产病毒载体的细胞基因水平稳定、平均,使产生的病毒载体产品质量稳定,工艺放大容易,单个批次生产的逆转录病毒载体可供多达1000名患者进行细胞治疗,这种大规模生产大大节约了成本。

采用逆转录病毒载体工艺已经上市的产品均定价较低,受益人群更多,从长远应用和效益来看,逆转录病毒载体具有很大优势。一项研究对1997年包装并储存的逆转录病毒载体上清液和2008年新鲜包装的病毒载体进行了对比,虽然10年的储存略降低了逆转录病毒载体的质量,但靶细胞的转导效率和增殖能力与2008年的对比并未显著下降,这说明逆转录病毒载体具有很强的稳定性。

慢病毒属于逆转录病毒科,是一种RNA病毒,是直径为80~120 nm的球形颗粒。

慢病毒载体(lentivirus vector,LVV)是一类改造自人类免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体,生产病毒滴度浓缩后可高达10⁹ TU/mL,通常用于细胞和基因治疗。它能够感染分裂期与非分裂期细胞,可利用逆转录酶将外源基因整合到宿主基因组中,并长期稳定表达,如神经元、造血干细胞和免疫系统细胞。

目前慢病毒载体生产制备的主要流程为:目的基因获取→构建质粒测序验证→转染HEK 293T→扩大培养→收获病毒上清液→纯化浓缩。

科研级慢病毒载体的生产过程使用普通培养瓶,收获病毒产量较低,仅供科学研究使用,纯化浓缩主要采用超滤柱浓缩法、PEG浓缩法或超速离心法。临床试验以及工业化生产需要大量慢病毒载体,因此会使用大规模制备设备,如采用多层培养系统、用悬浮培养生产慢病毒,纯化过程采用膜分离技术、离子交换色谱、亲和色谱、体积排阻色谱等技术,对洁净室环境要求也更高。

截至2020年9月，使用慢病毒载体进行活跃临床试验数量

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（来源：Large-Scale Production of Lentiviral Vectors: Current Perspectives and Challenges.）

本文旨在生物医药研究进展的分享,非治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导,请前往正规医院就诊。