CRISPR筛选揭示体外模拟CD8+T细胞耗竭中BHLHE40的作用
T细胞耗竭是在慢性感染和癌症的长期刺激下，T细胞丧失功能的状态。其主要表现为：增殖能力降低，抑制性受体（Inhibitory receptors，IRs）持续高表达，以及效应细胞因子减少等特征，其转录和表观遗传进程均被改变。无法持久地逆转CD8 T细胞衰竭仍然是治疗癌症和慢性感染的主要障碍。更好地了解诱导和维持衰竭的分子线索将有助于开发更有效的治疗方法来预防或逆转这种状态。体内模型已经产生了关于Tex的基础知识，但产生的细胞产量低，耗时，昂贵，难以规模化。因此，这些系统对于高通量筛选方法来说并不理想。
美国宾夕法尼亚大学的E.John Wherry团队多年来致力于T细胞耗竭相关研究，今日该团队在Science Immunology杂志发表题为In vitro modeling of CD8+ T cell exhaustion enables CRISPR screening to reveal a role for BHLHE40的文章，他们通过体外慢性刺激，构建了CD8 T细胞耗竭的模型，并以体内Tex模型为基准，对该体外模型从分子表型，转录水平和表观遗传水平评估，证明其体现了多种体内Tex的特征，然后通过对体外模型的CRISPR高通量测序，筛选出转录因子BHLHE40调控T细胞耗竭进程。
研究人员将P14 CD8 T细胞（特异性识别LCMV DbGP33-41表位的TCR）与DbGP33-41刺激的C57BL/6小鼠脾树突状细胞(DC)共培养，在第0天使用DbGP33-41多肽刺激后，慢性刺激模型每两天使用DbGP33-41和IL-2刺激，而急性模型仅加入IL-2。结果表明，慢性模型中细胞增殖受到抑制，且凋亡敏感性增加。虽然急性模型中IRs升高，但随时间减弱，而慢性模型中IRs表达更高，且持续表达。而慢性模型中的多种效应因子也更低，但仍高于体内Tex。
随后，研究人员针对体外耗竭模型进行测序，以探究其转录和表观遗传特征。RNA-seq结果显示，在d4时，慢性模型和急性模型定位一致，差异基因仅有634个，而在d7时差异基因达到2844个，表明二者具有相似的起始进程，而是在d7时发生分化，其中急性刺激P14细胞偏向于Tmem表型，而急性模型中则偏向Tex表型。基因富集分析中，体内Tex上调的基因在慢性模型的P14细胞中倾向富集，这些基因与T细胞激活的负调控相关。在针对表观遗传特征的ATAC-seq检测中，两模型中的P14细胞在d4均与Tex共定位，可能是与相关染色质可及性的激活有关。与转录水平一致的是，二者均表现出相似的初始途径，以及在d7出现分化。
在证明体外慢性刺激模型可以体现体内Tex的特征后，研究人员通过CRISPR筛选，希望可以找出调控Tex进程的相关转录因子。结果显示，BHLHE40在慢性模型中高频表达，并且在急性模型中并未出现，提示其可能与T细胞耗竭密切相关。研究人员通过shRNA敲低BHLHE40的方法，发现PD-1、Tim3等多种IRs下调，提示其可能促进IRs的表达。为测试BHLHE40在体内调节CD8 T细胞的功能，研究人员将BHLHE40 shRNA KD的P14细胞转入急性和慢性感染的小鼠体内，发现慢性感染的小鼠中BHLHE40敲低细胞有更强的增殖优势，而在急性模型中并未表现。而且在d31时，BHLHE40敲低细胞中部分IRs表达降低。同时，流式检测结果则表明，BHLHE40敲低促进了P14细胞从Tex中期细胞向Tex祖细胞的分化。
综上所述，本研究建立了一种体外T细胞耗竭模型，可以在很大程度上还原体内T细胞耗竭的特征，虽然不能完全模拟体内T细胞耗竭状态，但仍可用于高通量测序等研究，并因此发现转录调控因子BHLHE40在T细胞耗竭的进程中扮演重要的角色。
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