增强抗肿瘤活性和持久性的新策略之降低CAR-T细胞甲基化水平

图1 DNA甲基化与去甲基化示意图（图片来源biorender）

真核生物中的DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，可调节基因表达，在胚胎发育中至关重要。它涉及到遗传物质稳定、基因表达调控、X染色体失活、转座子沉默、组蛋白修饰等多个方面。发生DNA甲基化后，若在细胞分裂过程中不被纠正，就会诱发遗传病或癌症，且生物体甲基化的方式是稳定的，可遗传的。因此，DNA甲基化失调与人类疾病密切相关，例如自身免疫性疾病、代谢紊乱、神经系统疾病和癌症等^[2]。

DNA的甲基化改变包括高甲基化和低甲基化两种状态，其中DNA高甲基化是肿瘤早期诊断与预后判定的潜在生物学标志。当其发生高甲基化时，常导致细胞周期调控紊乱，DNA修复基因等转录沉默，从而导致许多细胞通路失活，影响正常细胞的生长调控分化，进而导致肿瘤的发生。例如，p16^INK4a基因启动子高甲基化存在于多种实体肿瘤中，如肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌或膀胱癌，以及黑色素瘤和胶质瘤。p16^INK4a的过表达参与了细胞衰老、衰老和细胞周期进程。该蛋白通过抑制周期蛋白依赖性激酶4和6来阻断细胞周期进程，而周期蛋白依赖性激酶4和6介导视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)在G1期的磷酸化，从而阻断细胞周期进程。DNA高甲基化导致p16^INK4沉默增加，导致pRB磷酸化水平增加，从而导致无限细胞增殖^[3]。而低甲基化效应则会导致DNA损伤增加、染色质解凝和染色体不稳定。此外，DNA低甲基化可以激活被高甲基化启动子沉默的基因。例如，来自 MAGEA 基因仅在精原细胞中表达，而不在其他体细胞组织中表达。然而，当它们的启动子发生去甲基化时，它们可在各种癌症中表达。通常MAGEA基因的异常表达与乳腺、肺和结直肠肿瘤的侵袭性和恶性增加有关^[4]。

DNA甲基化水平变化可推动肿瘤的发生发展，因此DNA去甲基化也成为了肿瘤治疗的重要方向。目前最常用的治疗策略就是开发小分子药物去调控DNA甲基化关键酶DNMT的活性。即针对DNMT的底物胞嘧啶设计胞嘧啶类似物，这些胞嘧啶类似物可以与DNMT发生共价结合，使DNMT无法从染色质上脱离，从而抑制其活性。目前胞嘧啶类似物已经有两种药物上市，分别是阿扎胞苷和地西他滨。阿扎胞苷是胞苷的嘧啶核苷类似物，在细胞摄取和酶促生物转化为三磷酸核苷酸后，将阿扎胞苷掺入DNA和RNA中，可通过抑制DNA/RNA甲基转移酶，抑制DNA合成和细胞增殖，减缓疾病进程。阿扎胞苷主要用作抗肿瘤药，临床上用于治疗乳腺癌、肠癌、黑色素瘤等。适用于在强化诱导化疗后首次完全缓解（CR）或首次完全缓解但血液计数未完全恢复（CRi），并且无法继续完成强化治疗的成人急性髓细胞性白血病患者。地西他滨是一种天然2′-脱氧胞苷酸的腺苷类似物，通过抑制DNA甲基转移酶，减少DNA的甲基化，从而抑制肿瘤细胞增殖以及防止耐药的发生。地西他滨是目前已知最强的DNA甲基化特异性抑制剂，属于S期细胞周期特异性药物本品。适用于 IPSS 评分系统为中危-1、中危-2 和高危的初治、复治骨髓增生异常综合征（MDS）患者，包括原发性和继发性的 MDS，按照 FAB 分型所有的亚型：难治性贫血，难治性贫血伴环形铁粒幼细胞增多，难治性贫血伴原始细胞增多，难治性贫血伴原始细胞增多-转化型，慢性粒-单核细胞白血病。

图2 阿扎胞苷和地西他滨结构式

CAR-T疗法是针对癌症的免疫疗法中最重要的新进展之一，并在血液肿瘤中取得了许多突破，但CAR-T疗法通常会受到T细胞耗竭的限制。临床上，对治疗中或复发后的活检样本进行分析将有助于确定CAR-T细胞衰竭导致患者疾病控制丧失的程度。有学者向B-ALL病人体内输注CD19靶向、基于4-1BB的CAR-T细胞，在4周后获取到了衰竭相关的DNA甲基化特征。另一项研究表明，CAR-T输注后几个月，慢性淋巴细胞白血病患者的血液中持续存在TIM3⁺PD-1⁺ CAR-T细胞，这些细胞在临床结果较差的患者中富集^[5]。如果CAR-T细胞确实因衰竭而受损，那么中断这种功能低下的细胞状态就会提高疾病的治疗效果。美国约翰霍普金斯大学西德尼基梅尔综合癌症中心Christopher J. Gamper 和 Kenneth R. Cooke团队研究发现DNA甲基转移酶3a（DNMT3a）是稳定活性T细胞反应的表观遗传机制重要组成部分^[6]。研究发现敲除CAR-T细胞的DNMT3a基因，能够防止T细胞衰竭，并增强抗肿瘤活性^[7]。同时地西他滨处理的CAR-T细胞，在体外和体内研究中的抗肿瘤活性、细胞因子产生和增殖均得到增强。此外，经过处理后CAR-T细胞可以在低剂量下清除体积庞大的肿瘤，并在肿瘤再攻击时建立有效的记忆反应^[8]。这些结果表明，DNMT3a可作为提高CAR-T疗法效果的通用靶标，与其联用为开发更有效的CAR-T细胞疗法提供了新的思路。

 

参考文献：

[1]Schübeler Dirk. ESCI award lecture: regulation, function and biomarker potential of DNA methylation. European journal of clinical investigation. 2015 Mar;45(3):288-93.

[2]Martisova Andrea, et al. DNA Methylation in Solid Tumors: Functions and Methods of Detection. International journal of molecular sciences. 2021 Apr 19;22(8):4247.

[3]Junan Li , et al. Regulatory mechanisms of tumor suppressor P16(INK4A) and their relevance to cancer. Biochemistry. 2011 Jun 28;50(25):5566-82.

[4]Poojary Manish, et al. Prognostic Value of Melanoma-Associated Antigen-A (MAGE-A) Gene Expression in Various Human Cancers: A Systematic Review and Meta-analysis of 7428 Patients and 44 Studies. Molecular diagnosis & therapy. 2020 Oct;24(5):537-555.

[5]Chow Andrew, et al. Clinical implications of T cell exhaustion for cancer immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Dec;19(12):775-790.

[6]Ktena YP, et al. Donor T cell DNMT3a regulates alloreactivity in mouse models of hematopoietic stem cell transplantation. J Clin Invest. 2022 Jul 1;132(13):e158047.

[7]Prinzing Brooke, et al. “Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity. Sci Transl Med. 2021 Nov 17;13(620):eabh0272.

[8]Wang Yao, et al. Low-dose decitabine priming endows CAR T cells with

enhanced and persistent antitumour potential via epigenetic reprogramming. Nat Commun. 2021 Jan 18;12(1):409.
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