敲除CTLA-4可以提高CAR-T细胞抗肿瘤疗效

2023年9月29日，Carl June教授团队在Immunity期刊发表了题为：Deletion of the inhibitory co-receptor CTLA-4 enhances and invigorates chimeric antigen receptor T cells  的研究论文。他们这项研究表明，CRISPR-Cas9介导的CTLA-4缺失改善了CAR-T细胞增殖和抗肿瘤疗效。
在机制上，CTLA-4缺失允许CD28的信号传导，并可维持T细胞表面的 CAR 表达。在临床研究中，CTLA-4的缺失挽救了以前CAR-T治疗失败的白血病患者的T细胞功能。因此，CTLA-4的选择性缺失使功能失调的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的T细胞重新活跃，为增加患者对CAR-T细胞治疗的反应提供了一种新的策略。 为了评估CRISPR/Cas9介导的PD-1和CTLA-4检查点受体缺失是否可以提高靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞（CART19）的疗效，他们制备了人源化的CART19细胞进行实验。在确保有效敲除的基础上，他们发现PD-1和/或CTLA-4缺失的CART19细胞表现出类似的增殖能力、记忆表型、抑制受体水平和表面CAR表达。同样地，WT和编辑过的CART19细胞显示出同等水平的细胞毒活性、脱颗粒能力等。 为了确定是否缺失PD-1和/或CTLA-4可以预防或延迟CAR-T功能障碍，他们开发了一种使用慢性抗原暴露（CAE）的体外应激试验。结果发现，与PD-1缺陷的CART19细胞和PD-1/CTLA-4均缺陷的CART19细胞相比，CTLA-4 缺陷的CART19细胞表现出双倍扩增能力和抗肿瘤功效增强。
在进一步的应激测试中，与WT、PD-1缺陷的CART19细胞和 PD-1/CTLA-4均缺陷的CART19细胞相比，CTLA-4缺陷的CART19细胞分泌的GM-CSF、IL-13和CCL5水平增加。在CAE刺激条件下，CTLA-4缺陷的CART19细胞都比WT细胞表现出更高的扩增能力和肿瘤清除能力。 CAR-T细胞如果失去表面CAR表达，则会导致CAR靶向功能障碍。CTLA-4缺失的CART19细胞在CAR功能障碍模型中显示出更高的抗肿瘤功效，这促使他们检测了WT和CART19编辑组中表面CAR表达的相对水平。与WT、PD-1缺失的CART19细胞以及PD-1/CTLA-4均缺失的CART19细胞相比，CTLA-4缺失的CART19细胞在应激检测中维持了表面CAR表达。同样地，在反复刺激后，NR和PR CLL患者的WT CART19细胞均表现出表面CAR表达百分比的降低，而CTLA-4缺失的CAR-T细胞则维持了表面CAR表达，并显示出显著改善的细胞杀伤活性，从而减少肿瘤负担。他们也借助小鼠模型验证了上述发现。

为了研究驱动CTLA-4缺失CAR-T细胞提高抗肿瘤疗效的分子途径，他们对CAE刺激后第0天和第15天的WT和CTLA-4缺失CAR-T细胞进行了单细胞转录组测序 （scRNA-seq）。为了深入了解CTLA-4的缺失如何影响T细胞的广泛分布，他们绘制了每个亚群中的相对细胞数量。有趣的是，在第15天，与WT CART19细胞相比，CTLA-4缺失的CART19细胞在增殖亚群中的细胞比例更高，而在终末效应亚群、应激亚群和凋亡亚群中的细胞比例更低。这些数据提供了关于CTLA-4缺失CAR-T细胞如何优于WT CAR-T细胞的见解。为了从体外应激功能障碍模型中识别功能障碍基因，他们在CAE刺激后第0天和第15天测定了差异表达基因。他们观察到了衰竭基因的上调，如CTLA-4、HAVCR2、LAG-3、KLRD1、IL-2RA、ENTPD1、GNLY、LAYN、CCL3、CCL4、TNFRSF18 和DUSP4。

为了从机制上理解CTLA-4缺失如何促进白血病患者CAR-T细胞在应激测试后抗肿瘤疗效的提高，他们鉴定并比较了来自ND和CLL CAR-T细胞的WT和CTLA-4缺失细胞的DEGs。在CTLA-4缺失的ND和CLL CAR-T 细胞中有许多常见的上调通路，糖酵解是唯一被下调的通路。在应激测试后的ND和CLL CTLA-4缺失CAR-T细胞中，参与细胞周期调控的通路也出现在上调的通路中。这表明，在CAR-T细胞中缺失免疫检查点CTLA-4促进了T细胞的扩增。
他们进一步在WT和CTLA-4缺陷的ND和CLL CAR-T细胞中检测了CD28下游靶点的表达。CTLA-4缺失CAR-T细胞显示GZMB、IL-2RA和 CDK6的上调，这些基因有助于更好的增殖和发挥效应功能。此外，与WT CART19细胞相比，CTLA-4缺失CAR-T细胞的CD28共刺激水平增强。这也在异种移植小鼠模型中得到了重现，即与WT CLL CAR-T细胞相比，CTLA-4缺陷小鼠的外周血CAR-T细胞中检测到细胞表面CD28的表达增加。基于这些数据，他们提出，CTLA-4在CAR-T细胞中的缺失导致了CD28信号的增强，从而维持了CAR-T细胞的共刺激和减少了CAR-T细胞功能障碍，这共同提高了CAR-T细胞的效应功能，增加了其增殖，并维持了细胞表面CAR的表达。

综上所述，该研究发现并证明了CTLA-4缺失的CART19细胞在应激测试条件下具有优越的抗肿瘤功效，更加重要的是，他们证实了这些结果的临床相关性，即 CTLA-4的缺失可以增强人类T细胞的适应性，并能够从失败的CLL患者T细胞中制造出有效的CART19细胞产品。总之，CTLA-4的缺失可以激活患者的T细胞，为增加CAR-T细胞治疗的持久反应提供了一种新的策略。

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